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O surto da doença de coronavírus 2019 (COVID-19)

O surto da doença de coronavírus 2019 (COVID-19) causado pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2/2019-nCoV) representa uma séria ameaça à saúde pública global e às economias locais. Em 3 de março de 2020, mais de 80.000 casos foram confirmados na China, incluindo 2946 mortes e mais de 10.566 casos confirmados em 72 outros países. Um número tão grande de pessoas infectadas e mortas exige uma demanda urgente de medicamentos eficazes, disponíveis e acessíveis para controlar e diminuir a epidemia.

Recentemente, relatamos que dois medicamentos, o remdesivir (GS-5734) e o fosfato de cloroquina (CQ), inibiram eficientemente a infecção por SARS-CoV-2 in vitro. O remdesivir é um pró-fármaco análogo de nucleosídeo desenvolvido pela Gilead Sciences (EUA). Um relato de caso recente mostrou que o tratamento com remdesivir melhorou a condição clínica do primeiro paciente infectado por SARS-CoV-2 nos Estados Unidos e um ensaio clínico de fase III do remdesivir contra o SARS-CoV-2 foi lançado em Wuhan em 4 de fevereiro de 2020. No entanto, como medicamento experimental, não se espera que o remdesivir esteja amplamente disponível para o tratamento de um número muito grande de pacientes em um maneira oportuna. Portanto, dos dois medicamentos em potencial, o CQ parece ser o medicamento de escolha para uso em larga escala devido à sua disponibilidade, registro de segurança comprovado e custo relativamente baixo. À luz dos dados clínicos preliminares, o CQ foi adicionado à lista de medicamentos em estudo nas Diretrizes para o diagnóstico e tratamento do COVID-19 (sexta edição) publicada pela Comissão Nacional de Saúde da República Popular da China.

CQ (N4- (7-Cloro-4-quinolinil) -N1, N1-dietil-1,4-pentanodiamina) tem sido muito utilizado no tratamento da malária e da amebíase. No entanto, o Plasmodium falciparum desenvolveu ampla resistência a ele e, com o desenvolvimento de novos antimaláricos, tornou-se uma opção para a profilaxia da malária. Além disso, uma overdose de CQ pode causar intoxicação aguda e morte. Nos últimos anos, devido à utilização pouco frequente de CQ na prática clínica, sua produção e oferta de mercado foram bastante reduzidas, pelo menos na China. O sulfato de hidroxicloroquina (HCQ), um derivado da CQ, foi sintetizado pela primeira vez em 1946 pela introdução de um grupo hidroxila na CQ e demonstrou ser muito menos (~ 40%) tóxico do que a CQ nos animais. Mais importante, o HCQ ainda está amplamente disponível para tratar doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatóide. Como o CQ e o HCQ compartilham estruturas e mecanismos químicos semelhantes, agindo como uma base fraca e imunomodulador, é fácil evocar a idéia de que o HCQ pode ser um candidato potente para tratar a infecção por SARS-CoV-2. Na verdade, em 23 de fevereiro de 2020, sete registros de ensaios clínicos foram encontrados no Chinese Clinical Trial Registry ( http://www.chictr.org.cn ) para o uso do HCQ no tratamento do COVID-19. Se o HCQ é tão eficaz quanto o CQ no tratamento da infecção por SARS-CoV-2 ainda carece de evidências experimentais.

Para este fim, avaliamos o efeito antiviral do HCQ contra a infecção por SARS-CoV-2 em comparação com o CQ in vitro. Primeiro, a citotoxicidade de HCQ e CQ em células VeroE6 de rim de macaco verde africano (ATCC-1586) foi medida pelo ensaio CCK8 padrão, e o resultado mostrou que os valores de 50% de concentração citotóxica (CC 50 ) de CQ e HCQ eram 273,20 e 249,50 μM, respectivamente, que não são significativamente diferentes um do outro (Fig. 1a ). Para comparar melhor a atividade antiviral de CQ versus HCQ, as curvas dose-resposta dos dois compostos contra SARS-CoV-2 foram determinadas em quatro diferentes multiplicidades de infecção (MOIs) pela quantificação dos números de cópias de RNA viral no sobrenadante celular aos 48 anos. h pós-infecção (pi). Os dados resumidos na Fig. 1ae a Tabela Suplementar S1 mostra que, em todos os MOIs (0,01, 0,02, 0,2 e 0,8), a concentração efetiva máxima de 50% (CE 50 ) para CQ (2,71, 3,81, 7,14 e 7,36 μM) foi menor que a do HCQ (4,51, 4,06, 17,31 e 12,96 μM). As diferenças na CE 50 os valores foram estatisticamente significativos a uma MOI de 0,01 ( P  <0,05) e MOI de 0,2 ( P  <0,001) (Tabela Suplementar S1 ). Vale a pena notar que os valores de CE 50 da CQ pareciam um pouco maiores do que no nosso relatório anterior (1,13 μM com um MOI de 0,05), provavelmente devido à adaptação do vírus na cultura de células que aumentou significativamente a infectividade viral após passagem contínua. Conseqüentemente, o índice de seletividade (SI = CC 50 / EC 50 ) de CQ (100,81, 71,71, 38,26 e 37,12) foi superior ao do HCQ (55,32, 61,45, 14,41, 19,25) em MOIs de 0,01, 0,02, 0,2, e 0,8, respectivamente. Esses resultados foram corroborados por microscopia de imunofluorescência, como evidenciado por diferentes níveis de expressão da nucleoproteína viral (NP) nas concentrações indicadas de fármacos às 48 h pi (Fig. Suplementar S1 ). Tomados em conjunto, os dados sugerem que a atividade anti-SARS-CoV-2 do HCQ parece ser menos potente em comparação com o CQ, pelo menos em certos MOIs.

figura 1
Fig. 1: Eficácia antiviral comparativa e mecanismo de ação de CQ e HCQ contra a infecção por SARS-CoV-2 in vitro.

Tanto o CQ quanto o HCQ são bases fracas, conhecidas por elevar o pH de organelas intracelulares ácidas, como endossomos / lisossomos, essenciais para a fusão da membrana. Além disso, o CQ poderia inibir a entrada do SARS-CoV através da alteração da glicosilação do receptor ACE2 e da proteína de pico. O experimento de tempo de adição confirmou que o HCQ inibiu efetivamente a etapa de entrada, bem como os estágios pós-entrada da SARS-CoV-2, que também foram encontrados no tratamento com CQ (Fig. Suplementar S2) Para explorar ainda mais o mecanismo de ação detalhado de CQ e HCQ na inibição da entrada de vírus, a co-localização de virions com endossomas precoces (EEs) ou endolisossomos (ELs) foi analisada por análise de imunofluorescência (IFA) e microscopia confocal. A análise de quantificação mostrou que, aos 90 min pi nas células não tratadas, 16,2% dos virions internalizados (anti-NP, vermelho) foram observados nos EEs positivos do antígeno 1 do endossomo 1 (EEA1) (verde), enquanto mais virions (34,3%) foram transportado para a proteína endossomal-lisossômica tardia LAMP1 + ELs (verde) ( n  > 30 células para cada grupo). Por outro lado, na presença de CQ ou HCQ, significativamente mais virions (35,3% para CQ e 29,2% para HCQ; P <0,001) foram detectados nos EEs, enquanto apenas muito poucos virions (2,4% para CQ e 0,03% para HCQ; P  <0,001) foram co-localizados com LAMP1 + ELs ( n  > 30 células) (Fig. 1b c ) Isso sugeriu que tanto o CQ quanto o HCQ bloquearam o transporte de SARS-CoV-2 dos EEs para os ELs, o que parece ser um requisito para liberar o genoma viral, como no caso do SARS-CoV.

Curiosamente, descobrimos que o tratamento com CQ e HCQ causou mudanças visíveis no número e tamanho / morfologia de EEs e ELs (Fig. 1c ). Nas células não tratadas, a maioria dos EEs era muito menor que os ELs. Nas células tratadas com CQ e HCQ, foram observadas vesículas de EE anormalmente aumentadas (Fig. 1c , setas nos painéis superiores), muitas das quais são ainda maiores que os ELs nas células não tratadas. Isso está de acordo com relatório anterior de que o tratamento com CQ induziu a formação de vesículas citoplasmáticas expandidas. Dentro das vesículas EE, os virions (vermelhos) foram localizados ao redor da membrana (verde) da vesícula. O tratamento com CQ não causou mudanças óbvias no número e tamanho dos ELs; no entanto, a estrutura regular da vesícula parecia ter sido interrompida, pelo menos parcialmente. Por outro lado, nas células tratadas com HCQ, o tamanho e o número de ELs aumentaram significativamente (Fig. 1c , setas nos painéis inferiores).

Como a acidificação é crucial para a maturação e função do endossoma, supomos que a maturação do endossoma possa ser bloqueada em estágios intermediários da endocitose, resultando em falha no transporte adicional de virions para o local de liberação final. Foi relatado que o CQ eleva o pH do lisossomo de cerca de 4,5 a 6,5 ​​a 100 μM 9 . Até onde sabemos, faltam estudos sobre o impacto do HCQ na morfologia e nos valores de pH dos endossomos / lisossomos. Nossas observações sugeriram que o modo de ação de CQ e HCQ parece ser distinto em certos aspectos.

Foi relatado que a absorção oral de CQ e HCQ em humanos é muito eficiente. Nos animais, os dois medicamentos compartilham padrões semelhantes de distribuição tecidual, com altas concentrações no fígado, baço, rim e pulmão, atingindo níveis 200 a 700 vezes superiores aos do plasma. Foi relatado que a dosagem segura (6 a 6,5 ​​mg / kg por dia) de sulfato de HCQ poderia gerar níveis séricos de 1,4 a 1,5 μM em humanos. Portanto, com uma dosagem segura, é provável que seja alcançada a concentração de HCQ nos tecidos acima para inibir a infecção por SARS-CoV-2.

A investigação clínica descobriu que alta concentração de citocinas foi detectada no plasma de pacientes críticos infectados com SARS-CoV-2, sugerindo que a tempestade de citocinas estava associada à gravidade da doença. Além de sua atividade antiviral direta, o HCQ é um agente anti-inflamatório seguro e bem-sucedido que tem sido amplamente utilizado em doenças auto-imunes e pode diminuir significativamente a produção de citocinas e, em particular, fatores pró-inflamatórios. Portanto, em pacientes com COVID-19, o HCQ também pode contribuir para atenuar a resposta inflamatória. Em conclusão, nossos resultados mostram que o HCQ pode inibir eficientemente a infecção por SARS-CoV-2 in vitro. Em combinação com sua função anti-inflamatória, prevemos que o medicamento tenha um bom potencial para combater a doença. Esta possibilidade aguarda confirmação por ensaios clínicos. Precisamos ressaltar que, embora o HCQ seja menos tóxico que o CQ, o uso prolongado e de overdose ainda pode causar intoxicação.

Contribuições

ZH, MW e WZ conceberam e projetaram os experimentos e forneceram a aprovação final do manuscrito. JL, RC, MX, XW, HZ, HH e YL participaram de várias experiências; todos os autores analisaram os dados. MW, RC, JL e ZH escreveram o manuscrito.

Autores correspondentes

Correspondência para Zhihong Hu ou Wu Zhong ou Manli Wang .

Fonte: Nature.

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